A. Mikrobiális fermentáció

B Eukariota sejt kultúrák

1. Upstream

    - bioreaktorok

    - medium

    - sterilizálás

    - oxigén

    - anaerob fermentálás

    - enzim reaktorok
 

2. Downstream

    - sejt izolálás

    - feltárás

    - extrakció

    - fehérje tisztítás

    - kiszerelés

Hol?

    gyógyszeripar

    élelmiszeripar

    vegyipar

    környezetvédelem

Mit?

    elsődleges anyagcsere termékei

    másodlagos anyagcsere termékei

    rekombináns fehérjék

    hulladék/veszélyes anyag lebontás
 

Miként?

    mikróba élettan

    fajok közötti kölcsönhatások

    anyagcsere utak változtatása - mol. biol.
 

Mekkora?

    1 liter - 10 000 000 liter
 

Milyen?

    * “standard”: levegőztetett, kevert tank

    GMP (good manufacturing practice)

    CIP (cleaning in place)

    DOT (dissolved oxygen tension)

    keverő teljesítmény/térfogat egység [@]

    t_mix = konst. x V^0.3

    Rushton vs. axial flow kevertető
 
 

*  “nem-mechanikusan kevert” fermentorok > 200 000 lit: air-lift

    heterogenitások (!)

* monitoring és kontroll [@]
 
 

Hogyan? (Process development)
 

Cél:

    új (vagy újszerű) termék

    jó minőségben

    gyorsan

    olcsón

    biztonságosan
 
 

Előnyös tulajdonságok:

    reprodukálható minőség

    előállítási ár

    beruházási igény

    termék fejlesztési idő

    léptéknövelhetőség [@]
 
 

Gazda:

kiválasztási szabályok: rekombináns

természetes
 
 

Jellegzetességek

    poszt-transzlációs modifikációk

    diszulfid hidak

    glikozilálás

    proteolízis

    foszforilálás

    amidálás

    acetilezés

    fizikai stabilitás

    vs. mikrobiális expresszió

    endotoxin

    költség

    refolding (pl. inzulin)
 
 

Fejlesztési irányok [@]

    szérum mentes medium

    kevert bioreaktorok (felületi kitapadás ? )

    monitoring és kontroll

    pH - CO₂ / NaOH

    kevertetés

    O₂
 
 

Alkalmazások

    humán diagnosztikumok és gyógyhatású fehérjék

    $ 5 milliárd / év »? biol. + gyógyszeripar

Kell: tökéletes folding

    glikozilálás

Különben:

    spec. aktivitás

    immunogenitás

    szérum élettartam

Sejtvonalak

    VERO -polio és szamárköhögés vaccina  (60 millió/év)

    CHO (Chinese hamster ovary)

    Myeloma -hibridómákhoz
 
 

Bioreaktor típusok

    Homogén

    szabad sejtes vagy microcarrieren

    kevertetett

    Heterogén

    bezárt vagy immobilizált sejtek ß gradiens van!

    (makropórusos kerámia, gumi, hollow fiber)
 

Fermentor működési elvek

    Batch

    Fed-batch

    Cut-and-feed batch

    Perfúziós (10⁸ sejt/ml)

    sejt visszatáplálás

    hollow fiber [*]
 
 

Fermentor megoldások
 

Laborméretben

* szabad sejtes (suspension cells)

* tömör microcarrierek

    - keresztkötött dextrán

    - polisztirol

    - cellulóz

    - zselatin

    - üveg

/ 100-230 m m bogyók

/sűrűség > medium (1.04 g/ml)

/ felület:térfogat

/ monolayer vs. multilayer
 
 

* kitapadó sejtek (adherent cells)

* mikrogömbökön

    (10-50 m m ß 4000 m m)

    gradiens: metabolitok, táp, sejtek

* immobilizálás

    agaróz, Ca-alginát, poliakrilamid, kitozán

 Ipari méretben [B4]

* Forgó edény

* Kevert bioreaktor (STB=stirred tank bioreaktor)

    1-5 10⁶ sejt/ml

* sejt visszatartó megoldások

    gravitáció

    forgó háló

    centrifuga

* air-lift

* hollow fiber

* kerámia blokk-csatornák

• fix ágyas reaktor

* Gazda sejtvonal

* expresszió szint

    (1-20 -  >100 pg/sejt/nap)

* retrovírusok

* genetikai stabilitás
 
 

* Medium

* szérum vs. kémiailag meghatározott

* költség
 
 

* Mol. biol.

* transzkripció, transzláció, szekréció

* Glikoprotein mikroheterogenitás

    felületi Asn tripeptidek eloszlása
 
 

* Oxigén ellátás

* buborékoktatás

* oldott O₂ membránon át
 
 

Jövő lehetőségei

* bakteriális vagy élesztő expresszió

* transzgenikus állatok (10000 lit tej/tehén/év)

* szövet regenerálás

(terápiás fehérje helyett sejt terápia)

Ugrás az első fóliához